二代测序
第二代测序（Next-generation sequencing，NGS）又称为高通量测序（High-throughput sequencing），是基于PCR和基因芯片发展而来的DNA测序技术。相比于一代测序的合成终止测序方法，二代测序开创性地引入了可逆终止末端，可以实现边合成边测序。二代测序在DNA复制过程中通过捕捉新添加的碱基所携带的特殊标记（一般为荧光分子标记）来确定DNA的序列，现有的二代测序技术平台主要包括Ion torrent、Illumina和华大MGI平台等。由于在二代测序中，单个DNA分子必须扩增成由相同DNA组成的基因簇，然后进行同步复制，来增强荧光信号强度从而读出DNA序列；而随着读长增长，基因簇复制的协同性降低，导致碱基测序质量下降，这严格限制了二代测序的读长（不超过500bp），因此，二代测序具有通量高、读长短的特点。目前二代测序（NGS）主要包括宏基因组二代测序技术（metagenomics next-generation sequencing, mNGS）和病原靶向测序技术（Targeted Next-generation Sequencing，tNGS）。 mNGS是借助二代测序平台快速测序获得样品中的核酸序列，并进一步与各个物种的基因组序列对比，从而得知样品中微生物的种类和比例的技术。mNGS具有检测全面，准确率高，敏感度高和时间短的优势。鉴定样品中病原微生物时，mNGS可以补充或替代传统的生化、免疫和培养方法，更快更加准确地取得结果。更重要的是，传统方法在应对少见、罕见感染，新发性感染时常常束手无策，mNGS通过检测样品中全微生物物种，从而找出潜在的致病微生物，指导用药。同时mNGS有一定的局限性。首先，由于临床样本中人源核酸的占比较高，导致病原微生物检测灵敏度降低，也使得其耐药、毒力基因存在漏检风险。其次，由于mNGS测序是随机片段测序，测序时未必覆盖分型区段，可能导致近源病原体无法精准分型。
tNGS是一种只针对特定基因序列进行高通量测序的技术，通过大量针对特定基因序列的引物探针对待测样品中抽提出的核酸进行超多重PCR扩增/探针捕获，获得大量目标核酸片段，再对这些目标核酸片段进行高通量测序，然后对所得序列进行生信分析，从而实现对待测样本中的核酸进行高灵敏以及高分辨率的识别。靶向富集（Target enrichment）是tNGS技术的关键环节，通过对目标基因组区域（regions of interest ，ROI）进行富集，确保ROI区域有足够的测序深度和覆盖度，进而成功地识别目标病原体。目前国内外策略主要分为两种：基于超多重PCR扩增的tNGS和基于杂交捕获的tNGS 。 相比mNGS，tNGS有以下技术优势：1.富集增加目标微生物检测覆盖，提升检测可信度；2. NGS可稳定的进行耐药或毒力基因的检测；3. tNGS检测因目标病原体设定范围明确，可以显著简化解读流程。但是tNGS也有一定的局限性，tNGS的检测panel是依据已知病原设计的，因此tNGS不适用于新发病原的检测。
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